NADH氧化酶（NOX）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書
可見分光光度法
貨號(hào)：BC0630
規(guī)格：50T/24S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：
試劑六：臨用前加入9 mL雙蒸水，用不完的試劑-20℃分裝保存。
產(chǎn)品說(shuō)明：
NOX（EC 1.6.99.3）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，可在氧氣存在下，直接將NADH氧化為NAD⁺。該酶不僅參與NAD⁺的再生，而且與免疫反應(yīng)密切相關(guān)。
NOX能夠?qū)?span style="font-family: Times New Roman, Times, serif;">NADH氧化為NAD⁺，NADH的氧化與2,6二氯酚靛藍(lán)（DCPIP）的還原相偶聯(lián)，藍(lán)色的DCPIP被還原為無(wú)色的DCPIP，在600nm下測(cè)定藍(lán)色DCPIP的還原速率計(jì)算出NADH氧化酶活性的大小。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、冰、蒸餾水。
操作步驟：“具體操作步驟詳見“產(chǎn)品資料"附件"
注意事項(xiàng)：
1、粗酶液的提取必須在0℃- 4℃中操作完成，以防止酶變性失活。
2、比色皿中反應(yīng)液的溫度最好保持37℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃水浴鍋中。在反應(yīng)過(guò)程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。
3、最好兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
4、實(shí)驗(yàn)時(shí)，試劑六樣本在冰上放置，以免變性和失活。
5、推薦使用樣本蛋白濃度計(jì)算酶活，若用樣本質(zhì)量計(jì)算，則需加測(cè)胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。
6、附：使用樣本鮮重計(jì)算公式：
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。
NOX上清活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA1÷0.01×V反總÷(W÷V提取×V樣)÷T=2525×ΔA1÷W
NOX沉淀活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA2÷0.01×V反總÷(W÷V樣總×V樣)÷T=505×ΔA2÷W
NOX活性（U/g 質(zhì)量）= NOX上清+ NOX沉淀=2525×ΔA1÷W +505×ΔA2÷W
 ΔA1：上清測(cè)定值；ΔA2：沉淀測(cè)定值；V反總：反應(yīng)總體積，1mL；V樣：加入樣本體積，0.04mL；V提?。?/span>
加入試劑一體積，1.01mL；V樣總：沉淀重懸體積，0.202mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。
實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g肺部樣本進(jìn)行樣本處理，按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得ΔA1=ΔA測(cè)定-ΔA對(duì)照=（0.841-0.094）-（0.956-0.849）=0.64，ΔA2=ΔA測(cè)定-ΔA對(duì)照=(0.945-0.471)-(1.009-0.982)=0.447，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

NOX上清活性（U/g 質(zhì)量）=2525×ΔA1÷W=2525×0.64÷0.1=16160
NOX沉淀活性（U/g 質(zhì)量）=505×ΔA2÷W=505×0.447÷0.1=2257.35
NOX活性（U/g質(zhì)量）=NOX上清+NOX沉淀=2525×ΔA1÷W +505×ΔA2÷W
=2525×0.64÷0.1+505×0.447÷0.1=16160+2257.35=18417.35 U/g 質(zhì)量。

1. 取0.1g葉片樣本進(jìn)行樣本處理，按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得ΔA1=ΔA測(cè)定-ΔA對(duì)照=（0.875-0.812）-(0.903-0.888)=0.048，ΔA2=ΔA測(cè)定-ΔA對(duì)照=（0.919-0.868）-（0.91-0.879）=0.02，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

NOX上清活性（U/g 質(zhì)量）=2525×ΔA1÷W=2525×0.048÷0.1=1212
NOX沉淀活性（U/g 質(zhì)量）=505×ΔA2÷W=505×0.02÷0.1=101
NOX活性（U/g 質(zhì)量）=NOX上清+NOX沉淀=2525×ΔA1÷W +505×ΔA2÷W
=2525×0.048÷0.1+505×0.02÷0.1=1313 U/g 質(zhì)量。
相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)：

1. Dou S, Liu S, Xu X, et al. Octanal inhibits spore germination of Penicillium digitatum involving membrane peroxidation[J]. Protoplasma, 2017, 254(4): 1539-1545.

2. Liu P, Zhang H M, Hu K, et al. Sensory plasticity of carotid body is correlated with oxidative stress in paraventricular nucleus during chronic intermittent hypoxia[J]. Journal of cellular physiology, 2019, 234(8): 13534-13543.

3. Yongtao Du,Mengjie Zhao,Changtao Wang,et al. Identification and characterization of GmMYB118 responses to drought and salt stress. BMC Plant Biology. December 2018;(IF3.67)

4. Youqiang Xu,Chunyan Xu,Xiuting Li,et al. A combinational optimization method for efficient synthesis of * by the recombinant Escherichia coli. Biochemical Engineering Journal. January 2018;(IF3.371)

5. Weida Li,Kai Wang,Nanfang Jiang,et al. Antioxidant and antihyperlipidemic activities of purified polysaccharides from Ulva pertusa. Journal of Applied Phycology. April 2018;(IF4.784)

參考文獻(xiàn)：

1. Kawai S, Mori S, Mukai T, et al. Cytosolic NADP phosphatases I and II from Arthrobacter sp. strain KM: implication in regulation of NAD⁺/NADP⁺ balance[J]. Journal of Basic Microbiology: An International Journal on Biochemistry, Physiology, Genetics, Morphology, and Ecology of Microorganisms, 2004, 44(3): 185-196.

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